Neutralrot-Test

Prinzip

Der Neutralrot-Test (Neutral Red Uptake Assay (NRU-Test)) ist ein Zytotoxizitätstest, der toxische Wirkungen von Chemikalien oder Umweltproben auf die Zellmembran nachweisen kann. Er beruht auf einer Färbereaktion durch die lebende von toten Zellen unterschieden werden. Geprüft wird üblicherweise mit den permanenten adhärenten Zelllinien HEP-G2 (humane Leberkarzinomzelle) oder V79 (Lungenepithel des chinesischen Goldhamsters). Aber auch viele andere Zelllinien wie z.B. humane Keratinozyten oder auch Fischzellen können verwendet werden.

Kurzbeschreibung

In der Mikrotiterplattenversion wird die monolayer Zellkultur, die über 24 Stunden am Gefäßboden aufgewachsen ist, für eine bestimmte Zeit (i.d.R. zwischen 2 und 24 Stunden) gegenüber einer Konzentrationsreihe der zu prüfenden Substanz exponiert. Durch Zugabe eines Rattenleberhomogenisats, dem sogenannten S9-Mix, kann die metabolische Umsetzng potenziell toxischer Schadstofffe simuliert werden. Am Ende der Expositionszeit werden die Zellen gewaschen und mit der Neutralrotfärbereagenz, einem schwach kationischen Vitalfärbestoff, versetzt. Er passiert die Zellmembran und bindet intrazellulär an Carboxyl- und Phosphatgruppen. Die Farbstoffakkumulation erfolgt im Wesentlichen in den zellulären Lysosomen. Tote und membrangeschädigte Zellen können den Farbstoff nicht akkumulieren und dieser wird während der anschließenden Wasch- und Fixierungsschritte nicht intrazellulär zurückgehalten. Daher sind Ansätze mit toten und geschädigten Zellen oder mit einer reduzierten Zellvermehrung weniger stark gefärbt als solche mit vitalen Zellen. Die Auswertung erfolgt über eine Rücklösung des zellulär gebundenen Farbstoffs und dessen fotometrische Vermessung im Vergleich zu einer unbehandelten Kontrolle. Die Toxizität wird als prozentuale Hemmung der Neutralrotrücklösung angegeben [%] und stellt ein Maß für die Schädigung der Zellen dar. Über die Dosis-Wirkungskurve kann der EC50 berechnet werden.