Mouse Lymphoma Assay (MLA)

OECD 476, EG 440/2008 B.17, ICH S2B

Prinzip

Mutagenitätstest mit der Mouse-Lymphoma Zelllinie L5178Y Tk +/-, Subklon C.3.7.2.

Kurzbeschreibung

Der Mouse-Lymphoma-Assay dient dem Nachweis möglicher Mutagene und Karzinogene in Säugerzellen. Bei der verwendeten Zelllinie wird die Induktion von Mutationen im autosomalen Thymidin-Kinase Gen nachgewiesen, die einen Funktionsausfall des Gens nach sich ziehen. Da bei autosomalen Genen hierfür Mutationen auf beiden Allelen notwendig wären, wird von der Zelllinie L5178Y der Klon Tk+/- 3.7.2.C verwendet, der bereits ein mutiertes Tk-Allel besitzt. Auch ohne funktionierendes TK-Gen (Tk-/-) können die Zellen weiter proliferieren, da Thymidin auch über Neusynthese hergestellt werden kann. Im Gegensatz zu Tk+/- und Tk+/+ Zellen können Tk-/- Zellen allerdings auch in Anwesenheit von Trifluorthymidin (TFT) überleben, während für die erstgenannten (Tk+/-, Tk+/+) dieses Thymidin-Analogon durch die Aktivität der zellulären Thymidin Kinase toxisch ist und zu ihrem Absterben führt. Somit kann Trifluorthymidin (TFT) zur Mutantenselektion verwendet werden. Zur Ermittlung des clonalen Wachstums („cloning efficiency“, Toxizitätsparameter) und der Mutantenhäufigkeit werden die Zellen in 96-Well Mikrotiterplatten ausgesät. Mutierte Zellen (TFT-resistent) bilden über einen Testzeitraum von mindestens 11 Tagen Kolonien aus, die mikroskopisch detektiert und in kleine und große Kolonien unterschieden werden können. Hierbei wird ein unterschiedlicher Gendefekt angenommen, kleine Kolonien werden von Zellen mit Chromosomenmutationen, große Kolonien von solchen mit Genmutationen gebildet. Deshalb werden bei der Auswertung neben der Mutationshäufigkeit auch die Raten für kleine und große Kolonien bestimmt.

Kriterium

Ein positiver Effekt muss eine Erhöhung der Mutanten von mindestens 100 pro 106 Zellen über der Rate der Negativkontrolle aufweisen. Zusätzlich wird mit einen ANOVA-Test (z.B. SigmaStat) die Signifikanz überprüft.

Substanzeigenschaften

Der Mouse-Lymphoma-Assay eignet sich für in Wasser oder anderen kompatiblen Lösemitteln lösliche Substanzen sowie für Wasserproben.